Культура клеток и моя культура
Понедельник. Рабочая неделя началась с семинара, на котором каждый рассказал о своих планах на предстоящую неделю. Все обсуждали всех.
С последнего семинара в целом было понятно, кто в каком направлении движется, сейчас шло обсуждение этих шагов. В целом оформилось четыре направления. Первое обнаружение белков, взаимодействующих в клетке с изучаемым нами белком Rpn4. Второе изучение структуры генов, которые регулируются белком Rpn4. Третье изучение образования белка Rpn4 в клетке. И четвертое изучение участия отдельных частей белка в его работе в клетке. Я задействован в четвертом направлении. Если по первому и второму направлению, так сказать еще конь не валялся, то по четвертому, а особенно по третьему уже есть результаты. Я представил небольшой план. На этой неделе я намерен поставить контрольный эксперимент, в котором на уровне работы, генов я посмотрю, есть ли отличия в работе генов в дрожжевых клетках, когда эти клетки растут на полной и на селективной среде.
Вторник. В научной работе есть такое понятие, как схема эксперимента. Каждый эксперимент состоит из нескольких простых, следующих друг за другом этапов работы, которые ведут к получению научного результата. В схеме эксперимента описывается, что это за этапы и в каком порядке они выполняются. Схема моего эксперимента такова.
Сначала культура клеток дрожжей выращивается, до определенной фазы роста, далее из клеток выделяется вся РНК, потом в пробирке с помощью специального фермента (он называется ревертаза) на матрице этой РНК синтезируется ДНК (по-научному реакция обратной транскрипции, сокращенно ОТ); эта ДНК называется кДНК (ДНК-копия) и на заключительном опыте с помощью ПЦР в этой реакционной смеси (ОТ-смесь) определяется относительное количество кДНК определенных генов. Всего 4 этапа. Это основные.
Кроме них я делаю контрольные опыты. Это нужно для того, чтобы убедиться в том, что на предыдущем этапе получен заданный промежуточный результат. В моем эксперименте их два.
В первом контрольном опыте я убеждаюсь в том, что РНК из клеток выделена и что она в процессе выделения она не была испорчена клеточными ферментами. Для этого я делаю электрофорез препарата выделенной из клеток РНК в агарозном геле. Если препарат хороший, то в геле должны быть четко видны видны две полосы это РНК из рибосом, ее в клетке 80-90%. Если РНК при выделении разрушается клеточными ферментами, то в геле виден только шмер. Во втором контрольном опыте я убеждаюсь в том, что в препарате этой РНК нет примесей ДНК, и что в ОТ-смеси прошел синтез кДНК. Для этого я ставлю ПЦР, где в качестве матрицы использую либо препарат РНК, либо ОТ-смесь.
Продукты ПЦР реакции я разделяю в агарозном геле. Если все хорошо, то получается красивая картина чередования полос и пустых мест, полоса там, где в реакцию взята ОТ-смесь и пусто там, где на ПЦР взята просто РНК (на чистой РНК реакция не идет). Если все хорошо, то я делаю основной опыт: с ОТ-смеси ставлю ПЦР с радиоактивной меткой на интересующие меня гены. Продукты такого ПЦР уже разделаются в полиакриламидном геле. Гель высушивается и закладывается в светонепроницаемую кассету с рентген-чувствительным экраном. Потом этот экран сканируется на специальном приборе, называемом «Циклон» (по англ. Cyclone). Результаты сканирования выводятся на экран компьютера и полученные данные обрабатываются в программе OptiQuant.
Сегодня я почитал статьи и посеял клетки дрожжей в питательные среды: полную и селективную, чтобы за ночь их выросло достаточно для опыта.
Среда. Культуры выросли. Я рассеял ночные культуры в свежие среды и дождался пока они дорастут до нужной фазы. Наступление нужной фазы роста контролируются с помощью прибора называемого спектроэлектрофотометром. Он измеряет поглощение растворов при заданной длине световой волны, которая пропускается через этот раствор. Для культуры клеток измеряется поглощение света при длине волны 600 нм. Когда оно будет равно единице для одного миллилитра культура это означает, что нужная фаза роста наступила. Для этого потребовалось 7 часов. Когда клетки выросли я выделил из РНК.
Четверг. Сделал электрофорез РНК. Во всех препаратах РНК отличного качества! Поставил синтез кДНК. Вечером пошел на Хастл-дискотеку. Перед субботним конкурсом надо немного тренироваться.
Пятница. Сделал контрольный ПЦР. кДНК синтезировалась и примесей ДНК в препарате РНК нет. Можно ставить основной эксперимент. Получил радиоактивную метку.
Суббота. В институте посидел в Интернете, пообщался. Конкурс проводился в ночном клубе «Вернисаж». Моя партнерша опоздала на полчаса. Я едва дождался, уже хотел уходить. Выступление не удалось были серьезные ошибки. Наверное, от волнения. Мы не прошли даже в 1/8 финала. Я расстроился. Не стал дожидаться окончания соревнований и ушел.
В воскресенье просто посидел в Интернете
Продолжение следует
